2016年年底，某猪场仔猪食欲不振，精神萎靡，并伴有发热、咳嗽、呼吸困难等症状。对4头发病仔猪进行剖检，取病变组织进行病原学鉴定，结果检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌和链球菌。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊为猪蓝耳病继发副猪嗜血杆菌感染。

由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称猪蓝耳病，是对全球养猪业影响最大的猪传染病之一，该病毒主要引起妊娠母猪的繁殖障碍及各年龄段猪特别是仔猪的呼吸道症状，感染率和死亡率极高，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎，主要症状为发热、咳嗽、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。副猪嗜血杆菌病的主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般在10% ~ 15%，严重时死亡率可达50%。

1 发病情况及临床症状

某猪场仔猪出现食欲不振、厌食、精神倦怠、生长发育迟缓。发病仔猪出现发热、呼吸困难并伴有咳嗽等症状。对发病仔猪的肺部进行触诊，按压时有波动感和摩擦感，仔猪在按压使有疼痛感并发出尖叫声。剖检发现病猪心肺部病变明显，主要表现为心包炎，心包大量积液并伴有炎性渗出物（图1），心包膜与心脏黏连（图2）。肺部有淤血及炎症反应，胃肠道出现胀气，脾脏边缘不规则并有淤血等病理变化（图3）。

2 实验室诊断

2.1 材料

2.1.1 血样采集

对4头发病仔猪进行前腔静脉采血5 mL，析出血清，用于血清学诊断

2.1.2 仔猪剖检

对4头发病仔猪（耳号分别为72、78、1718、1750）进行病理剖检，分别剪取出肺脏、腹股沟淋巴结、脾脏等病变组织并收集心包液用于病原体的PCR鉴定。

2.1.3 试剂

2×Taq PCR StarMix with Loading Dye（GenStar）、病毒DNA/RNA提取试剂盒（Magen）、RT-PCR试剂（Takara）

2.2 方法

2.2.1 PCR鉴定

2.2.1.1 引物合成

参考NCBI上猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌特异蛋白的基因序列，用Primer 5.0 软件分别设计了它们具有高特异性和敏感性的引物，对分离到的疑似猪蓝耳病毒、链球菌和副猪嗜血杆菌进行PCR鉴定，引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。 

2.2.1.2 PCR模板

病料DNA/RNA提取：剪取病变明显的部位，放入装有磁珠的EP管中，加入500 μL的PBS，组织破碎仪将组织磨碎，10000×g离心2 min，吸去上层组织液，每头猪的各个组织破碎液、心包液及血液混为一管，之后提取病原体基因组或RNA，按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书进行。

2.2.1.3 PCR反应体系及反应条件 

猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR反应体系：病毒RNA的反转（10 μL）：RNA模板2 μL ，5×Buffer 2 μL，反转引物（PRRSV-NSP2-R3） 0.5 μL，dNTP 0.5 μL，RNase inhibitor 0.25 μL，RTass M-MLV 0.5 μL，ddH2O 4.25 μL；一次PCR体系（20 μL）：反转cDNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物(PRRSV-NSP2-F/R)各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（PRRSV-OutF/ER）各1 μL，ddH2O 7 μL。

猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30s，72 ℃延伸55 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

副猪嗜血杆菌套式PCR反应体系：一次PCR体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Outer-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Inner-F/R）各1 μL，ddH20 7 μL。

副猪嗜血杆菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

猪链球菌PCR反应体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（SS-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL。

猪链球菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

经5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

3 结果

3.1 病料的PCR鉴定

由PCR电泳图可知，用猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR引物对4头发病仔猪剖检病料进行检测，2号猪扩增出250 bp阳性条带，与蓝耳高致病毒株条带大小吻合，提示2号猪检测到蓝耳高致病毒株（图4）。用副猪嗜血杆菌PCR套式引物在送检的4头发病仔猪肺脏、心包液等组织混合液中均扩增出197 bp阳性条带，提示这些样品检测到副猪嗜血杆菌抗原（图5）。同时用猪链球菌PCR引物对4头发病仔猪剖检病料进行检测，其中2号猪扩增出了207 bp阳性条带，提示这些样品检测到链球菌抗原（图6）。综合上述PCR鉴定结果，送检4头发病仔猪均检测到副猪嗜血杆菌抗原；只有2号猪检测到链球菌和蓝耳抗原（表1）。

M：DNA分子Marker；1-4为送检发病仔猪；“CHR6+”表示经典毒株阳性对照，340bp；“Li11+”表示高致病毒株阳性对照，250bp；“－”表示阴性对照

M：DNA分子Marker；1-4为送检发病仔猪；“+”表示阳性对照；“－”表示阴性对照；阳性条带为197 bp

M：DNA分子Marker；1-4为送检发病仔猪；“+”表示阳性对照；“－”表示阴性对照；阳性条带为207 bp

4 结论

在送检的4头发病仔猪的剖检病样中经实验室PCR鉴定均检测到了副猪嗜血杆菌，而2号发病仔猪同时检测到了蓝耳病毒和链球菌。根据剖检发病仔猪出现的心包积液、心包炎等病理变化，与副猪嗜血杆菌引起的病变相似，更进一步验证了副猪嗜血杆菌的感染。临床上细菌病发病率最高是副猪和链球菌，根据检测结果并结合剖检变化，确诊了仔猪发病原因为：蓝耳继发副猪、链球菌感染，且副猪感染严重。建议通过细菌分离、药敏实验，筛选敏感抗生素治疗，并加强蓝耳防控。

原标题：蓝耳继发副猪嗜血杆菌感染案例分析

文｜郭春和，朱振邦，陈瑶生，刘小红

中山大学生命科学学院 有害生物控制与资源利用国家重点实验室

摘自《猪业》2017年第2期

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