江西某猪场保育仔猪和产房仔猪出现严重的关节肿胀、跛行、行动困难等现象，对发病仔猪进行剖检，取病变组织进行病原学鉴定，结果鉴定出有链球菌和副猪嗜血杆菌。对病料进行细菌的分离培养，结果分离出了链球菌及副猪嗜血杆菌。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊为猪链球菌和副猪嗜血杆菌混合感染。

猪链球菌病是由D、E、L群链球菌以及猪链球菌等引起的猪的疫病的总称，临床上主要表现为淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎以及败血症等症状。猪链球菌病也是人兽共患传染病，严重危害生物安全及公共卫生。

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎，主要症状为发热、咳嗽、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。副猪嗜血杆菌病主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般在10% ~ 15%，严重时死亡率可达50%。

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发病情况及临床症状

江西某猪场仔猪陆续出现行动困难、跛行、蹄不着地等症状，仔猪四肢关节出现不同程度的肿大，触诊有波动感，有的猪的关节按压时有摩擦感，用力按压猪有疼痛感。剖检发现心包有积液，肺脏有部分淤血。划开后肢关节有大量的黄色脓性渗出物，关节腔内有黄色积液，关节囊、滑膜严重增生，关节腔内出血充血严重，且有炎性增生（图1）。

图1 送检仔猪的临床症状及病理变化。（A）仔猪后肢关节肿胀（B）划开关节皮肤，有大量化脓性渗出物（C）关节腔内有黄色积液，关节囊、滑膜严重增生，关节腔内出血充血严重，且有炎性增生。

02

实验室诊断

2.1 材料

2.1.1 血样采集

对2头发病仔猪进行前腔静脉采血5 mL，析出血清，用于血清学诊断

2.1.2 仔猪剖检

对2头发病仔猪进行病理剖检，分别剪取出肺脏、腹股沟淋巴结、脾脏等病变组织并收集心包液、关节液及关节脓性渗出物，用于细菌的分离培养和PCR鉴定

2.1.3 培养基及试剂

大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA，广东环凯微生物科技有限公司）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、胎牛血清、血平板、革兰氏染色液、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye（GenStar）、病毒DNA/RNA提取试剂盒（Magen）、RT-PCR试剂（Takara）

2.1.4 药敏试验材料

环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、卡那霉素、替米考星、磺胺甲恶唑、大观霉素、氨苄西林链霉素、新霉素、庆大霉素、阿莫西林、氟苯尼考、头孢曲松、头孢拉定、万古霉素、四环素共17种药敏试纸均购于OXOID公司

2.2 方法

2.2.1 PCR鉴定

2.2.1.1 引物合成

参考NCBI上猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌特异蛋白的基因序列，用Primer 5.0 软件分别设计了它们具有高特异性和敏感性的引物，对分离到的疑似猪蓝耳病毒、链球菌和副猪嗜血杆菌进行PCR鉴定，引物序列及扩增片段长度，由苏州泓迅生物科技有限公司合成（表1）。

表1 猪链球菌及副猪嗜血杆菌引物设计

2.2.1.2 PCR模板

病料DNA/RNA提取：剪取病变明显的部位，放入装有磁珠的EP管中，加入500 μL的PBS，组织破碎仪将组织磨碎，之后按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书进行基因组提取：用接种环勾取单个纯化培养后的菌落，加入到500 μL的液体培养基中，37 ℃摇菌过夜，以此作为PCR反应的模板。同时做阳性对照及阴性对照。

2.2.1.3 PCR反应体系及反应条件

猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR反应体系：病毒RNA的反转（10 μL）：RNA模板2 μL ，5×Buffer 2 μL，反转引物（GP5-R1） 0.5 μL，dNTP 0.5 μL，RNase inhibitor 0.25 μL，RTass M-MLV 0.5 μL，ddH2O 4.25 μL；一次PCR体系（20 μL）：反转cDNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物(GP5-F1/R1)各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（GP5-F2/R2）各1 μL，ddH2O 7 μL。

猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

副猪嗜血杆菌套式PCR反应体系：一次PCR体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Outer-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL；二次PCR反应体系（20 μL）：第一次PCR产物 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（HPS-Inner-F/R）各1 μL，ddH20 7 μL。

副猪嗜血杆菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；一次PCR 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；二次PCR 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

猪链球菌PCR反应体系（20 μL）：菌体（病料）DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物（SS-F/R）各1 μL，ddH2O 6 μL。

猪链球菌PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

经5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

2.2.2 细菌分离培养

首先配制TSA平板（加有5%胎牛血清和1% NAD），将剪取的病变组织涂抹于TSA平板和血平板上，用接种环划线后置于37 ℃培养箱培养24 ~ 48 h，观察菌落形态，并挑取单菌落进行纯化培养。

2.2.3 革兰氏染色镜检

挑取纯化培养后的单菌落涂片，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗；滴加革兰氏碘液，1 min，水洗；滴加脱色酒精，约30 s；水洗后滴加沙黄复染液，复染1 min，水洗，待干，显微镜下观察细菌的形态特点。

2.2.4 药敏试验

挑取纯化培养的单个菌落加入500 μL的无菌培养基中37 ℃摇至培养基浑浊，离心后吸去部分上层液，取200 μL菌液至TSA平板中，用玻璃棒涂抹均匀，随后贴上各种药敏纸片，37 ℃培养24 ~ 48h，用直尺测量抑菌圈的直径，依据药品说明书判定结果（表2）。

表2 药敏实验判定标准

03

结果

3.1 病料的PCR鉴定

由PCR电泳图可知，用猪繁殖与呼吸综合征病毒套式PCR引物在发病仔猪解剖后的淋巴结、肺均未扩增出914 bp阳性条带，提示未检测到蓝耳抗原（图2）；用副猪嗜血杆菌PCR套式引物在发病仔猪解剖后的肺、心包液、腹股沟淋巴结及肿胀关节液等样品中扩增出197 bp阳性条带，提示检测到副猪嗜血杆菌抗原（图3）；用猪链球菌PCR引物在发病仔猪解剖后关节脓性渗出物、腹股沟淋巴结及肿胀关节液扩增出207 bp阳性条带，提示检测到链球菌抗原（图4）。

图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR鉴定结果。M：DNA分子Marker；“+”表示阳性对照，“－”表示阴性对照；编号前面3和5为发病仔猪耳号第一位数字；阳性条带为914 bp。

图3 副猪嗜血杆菌PCR鉴定结果。M：DNA分子Marker；“－”表示阴性对照；编号前面3和5为发病仔猪耳号第一位数字；阳性条带为197 bp。

图4 猪链球菌PCR鉴定结果。M：DNA分子Marker；“+”表示阳性对照，“－”表示阴性对照；编号前面3和5为发病仔猪耳号第一位数字；阳性条带为207 bp。

3.2 细菌的分离培养

将检测到含有副猪和链球菌病料深层组织接种在TSA培养基（5%胎牛血清+1%NAD）上分区划线培养24 ~ 48 h，在涂有发病仔猪的关节液和关节脓性渗出物的TSA平板上均长出了针尖大小、无色透明、边缘光滑整齐、湿润的菌落。同时涂有关节脓性渗出物的血平板上出现了明显的 β 溶血环，为 β 溶血（图5）。挑单菌落进行涂片及革兰氏染色镜检，发现关节脓性渗出物中的细菌镜下呈紫色，为革兰氏阳性菌；关节液中的细菌镜检呈红色，为革兰氏阴性菌（表3）。

图5 关节脓性渗出物在血平板上的菌落形态

3.3 细菌PCR鉴定

将TSA平板及血平板上的菌落纯化培养后进行细菌的PCR鉴定，挑出纯化的关节脓性渗出物的菌落用猪链球菌特异性引物均扩增出了207 bp大小的条带，大小与目的片段一致，结合菌落出现 β 溶血及革兰氏阳性菌，可判定为溶血性链球菌。挑出的纯化后关节液形成的菌落用副猪特异性引物均扩增出197 bp大小的条带，结合TSA上的菌落形态及革兰氏阴性菌，可判定为副猪嗜血杆菌（表3）。

表3 细菌分离培养后对菌落进行鉴定

3.4 药敏试验

对该猪场病猪分离到的副猪嗜血杆菌和猪链球菌进行药敏试验，结果如表所示（表4、表5、图6）。

表4 链球菌抑菌圈的测量结果（单位：mm）

表5 副猪嗜血杆菌抑菌圈的测量结果（单位：mm）

结果显示，所分离得到的链球菌对庆大霉素、阿莫西林、万古霉素高敏，对头孢曲松、头孢拉定极敏；分离所得的副猪嗜血杆菌对恩诺沙星、氧氟沙星、四环素高敏，对环丙沙星、阿莫西林、氟苯尼考、头孢曲松、头孢拉定、磺胺甲恶唑、万古霉素、氨苄西林极敏。

图6 部分药敏试验抑菌圈直径大小

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结论

结合该猪场发病猪的临床症状及病理变化，并对2头发病仔猪解剖进行实验室诊断，解剖2头发病仔猪，肺、心包液、腹股沟淋巴结及肿胀关节液检测到副猪；化脓、腹股沟淋巴结及肿胀关节液检测到链球菌。对链球菌和副猪进行细菌分离培养，通过对菌落形态、革兰氏染色及纯化后菌液PCR鉴定，进一步确诊了该猪场发病猪为副猪嗜血杆菌和溶血性链球菌混合感染。通过对链球菌和副猪做药敏实验，综合考虑，建议采用以下抗生素治疗：阿莫西林、庆大霉素、氟苯尼考及氨苄西林（联合使用），对发病猪只肌注给药，并对产房仔猪进行饮水、饲料拌药保健。

作者简介

郭春和：兽医博士，主要从事疫病检测防控及蓝耳病研究，以第一作者发表7篇SCI，总IF>14，申报国家发明专利8项，3项已授权。

原标题：副猪嗜血杆菌与猪链球菌混合感染案例分析

文｜郭春和1,朱振邦1，刘娜2，陈瑶生1，刘小红1

1. 中山大学生命科学学院 有害生物控制与资源利用国家重点实验室；

2. 肇庆农业学校

摘自《猪业》2017年第1期