猪弓形虫病诊断技术应用研究-驱虫管理-养猪信息网

原标题：猪弓形虫病诊断技术应用研究

作者：翁亚彪，林瑞庆，吴松明，张小刚，谭志坚

猪弓形虫病是一种对当前养猪生产造成较大困扰的寄生虫病。一方面，由于弓形虫可以感染包括猪在内的哺乳类、鸟类、啮齿类、爬行类、两栖类等200多种动物，其保虫宿主众多，感染来源丰富；另一方面，弓形虫的生活史较为复杂，在猫科动物的肠上皮细胞内进行球虫型发育，在猫体内经过裂殖生殖和配子生殖，最终形成卵囊，其中配子生殖是有性繁殖，因而猫科动物是弓形虫的终末宿主；在包括猪在内的其他动物体内只进行无性繁殖，形成滋养体（速殖子）和包囊（缓殖子），因此，这些动物是弓形虫的中间宿主。与那些有特定单一宿主，只有某个特定感染性阶段，通过某种特殊感染途径，才能致使宿主感染的诸多寄生虫相比，弓形虫的感染来源众多，在其发育的各个阶段（包括滋养体、包囊和卵囊），都可通过多种途径（包括经口、经皮肤黏膜和胎盘）令宿主遭受感染。这也许是弓形虫病流行广泛，令人防不胜防的主要原因。

1 传统诊断方法及其不足之处

1.1 病原学检查

取病死猪的肺、肝、淋巴结、腹水等病料做涂片，自然干燥后，经甲醇固定，用姬姆萨氏染色液染色后，置高倍显微镜（油镜）下观察。发现弓形虫速殖子（滋养体）、假包囊等即可确诊。上述各种病料又以肺脏及肺门淋巴结涂片的背景最清晰，最容易发现虫体，因而检出率较高。涂片染色镜检操作简便，但是，其不足之处主要是，该诊断方法是一种死后诊断，而且仅适合于弓形虫病急性暴发性病例。如果病程较长，受感染机体的免疫系统会迅速将大部分滋养体消除，或者经过投药治疗将虫体杀灭后，此时再做涂片染色镜检，往往检不到虫体。

1.2 血清学诊断

国内外已研究出多种血清抗体诊断试剂盒，供弓形虫病流行病学调查和生前诊断。人工感染弓形虫试验时，猪于感染后第5天，其血液中首先出现IgM抗体，约1周后出现IgG抗体，而且IgG抗体一直维持较高水平达半年以上，甚至一年之久。所以，血清IgG抗体阳性只能说明该猪过去某时曾受弓形虫感染，对当前是否为弓形虫病活跃期没有提示作用。因此，血清抗体诊断的不足之处是不能判断现症感染，对临床病例确诊没有太大意义。

2 现症感染诊断技术的建立与应用

2.1 弓形虫在猪体的感染发育过程

弓形虫卵囊或包囊被猪摄入后，虫体通过胃而保持其活力，继而进入肠道，卵囊中的子孢子或包囊中的缓殖子即将进入一个快速增殖阶段，在肠黏膜固有层发育成为滋养体（又称速殖子），然后通过淋巴和血液传播到全身，进入各组织中的巨噬细胞、淋巴细胞等形成假包囊，并繁殖出大量滋养体，同时引起组织器官损伤，猪只呈现急性感染状态，如果感染严重或猪只抗病力低下，可致使感染猪发病甚至死亡。但是，如果感染较轻或猪只抗病力较强，机体的免疫应答会将大部分滋养体迅速消灭，余下虫体在组织内形成包囊，其内含的缓殖子转入缓慢发育阶段，猪呈现隐性感染状态。

2.2 病料采集与弓形虫特异PCR诊断方法的建立

从弓形虫在猪体内的感染发育过程可以看出，猪只表现临床症状之前，在肠黏膜固有层发育的虫体通过血液传播到其他组织，因此，在其血虫症时期采集血液样品，进行活跃期虫体DNA的检测，比检测组织样品内可能处于潜伏阶段虫体的DNA，能够更好地揭示猪只是否存在弓形虫现症感染。血液样品不仅采集方便，而且还可生前诊断。

血液样品特异PCR诊断方法能通过扩增弓形虫特定的基因或序列片段证明弓形虫在血液中的存在，从而诊断活跃期弓形虫感染。建立弓形虫病特异PCR诊断方法的关键是寻找敏感、特异的遗传标记。我们比较了大量已报道的及我们实验室设计的引物，包括B1基因、ITS序列、529 bp重复序列、致密颗粒蛋白等，发现在猪血液样品弓形虫检测中，大多数引物敏感性不高，或容易出现假阳性，我们通过比较筛选获得敏感性高和特异性强的引物，优化条件后应用临床猪弓形虫病的血液检测。

2.3 现症感染诊断技术应用实例

对来自广东、福建、山东、安徽等地区10个集约化猪场送检的约500份样品进行特异PCR检测，主要是血液样品，血液样品场阳性率40%，代表性场检测结果见图1、图2和图3，目标条带约1200 bp。PCR阳性检出结果与猪场弓形虫病发生情况相符合，很好地反映了猪弓形虫病的现症感染情况。

表1 阳性场血液样品检测PCR图

表2 治疗恢复场血液样品检测PCR图

表3 阴性场血液样品检测PCR图

3 集约化猪场弓形虫感染预警系统的建立与应用

弓形虫病的感染来源可分为基本感染源（主要是猫科动物）和补充感染源（主要是啮齿动物）。猫是传播弓形虫病的最主要感染源，猫粪中的弓形虫卵囊可保持感染力达数月之久，卵囊可被某些食粪甲虫、蝇、蟑螂和蚯蚓机械性地传播，猪摄食了被卵囊污染的饲料、饮水而获得感染。另外，弓形虫的滋养体可以通过口、鼻、咽、呼吸道黏膜、眼结膜和皮肤等途径侵入动物体内。发病动物和带虫动物的肉、内脏、血液、渗出液和排泄物中均可能有弓形虫，乳中也曾分离出弓形虫，流产胎儿的体内、胎盘和其他流产物中也可能有大量弓形虫，这些虫体通过上述各种途径侵入猪体内后，令猪只感染发病。因此，有必要建立一种弓形虫感染预警机制，尽量降低弓形虫病对猪场造成的危害。

3.1 猪场弓形虫感染源样品的筛选

根据弓形虫传染来源和传播途径，通过特异PCR检测的样品主要如下：（1）患病动物的血液样品；（2）患病动物的分泌物：包括精液、尿液、奶等；（3）机械传播的媒介，主是要昆虫和鼠等生物；（4）卵囊污染的水源、饲料和土壤等；（5）传播弓形虫的中间宿主：主是是鼠等；（6）流产胎儿、弱仔的组织和血液；（7）怀疑弓形虫病的死亡猪体各种组织和血液：主要脑组织、肺组织和淋巴结等。其中，对操作的方便性、检出率及对现症感染的诊断上，我们推荐血液样品的检测，其他样品的检测对分析猪场弓形虫病的感染来源及传播途径上也有重要作用。

3.2 猪场弓形虫感染源样品阳性检出情况分析

最近我们从不同地区的10个猪场中血液样品检出阳性的有4个猪场，阳性样品经测序进一步验证为弓形虫感染，场阳性率为40%，单个场最高阳性率是100%，一些猪场的流产胎儿或弱仔样品呈阳性，猪场面对较大的弓形虫感染压力。某场的5份废料样品均为阳性，说明该场饲料污染比较严重，可能为猫、鼠或其他动物传播，需要加强生物防控。检测出阳性样品的还有水源样品，存在水源污染，是传播来源之一；鼠组织样品也检出阳性，说明鼠也可能是猪场传染弓形虫的重要媒介；其中有1个猪场送检5份精液样品有2份阳性，是否在传播弓形虫病中起作用，还需进一步验证。

3.3 猪场弓形虫感染源样品检出阳性与发病情况相关性分析

由于目前调查的样品有限，我们只能针对已调查猪场阳性情况作一分析。不同地区的10个猪场中血液样品检出阳性的有4个猪场，单个场样品阳性率最高为100%，其余三个场分别为73.5%、27.3%和10%。阳性率100%的猪场有较为明显的发热等弓形虫病典型症状，同时进行的附红细胞体检测也为100%感染；阳性率73.5%猪群多个猪只有弓形虫症状，同时有猪只死亡，剖检淋巴结肿大、肺出血和小叶间质增宽、肝脾坏死、心包胸腔积液等典型弓形虫病变；阳性率27.3%的猪群也出现弓形虫病症状。调查结果表明特异PCR检测与猪群发病情况相对应，而阳性率10%的猪场是发病恢复群，在前期发病并已经药物治疗，猪群情况良好，而血液检测何时能完全转阴需进一步研究。值得一提的是，在送检血样的猪场中，有送检样品用法国IDVET试剂盒检测皆为抗体值高的，但特异PCR检测皆为阴性；另外有两个场有抗体检测数据的，抗体阳性率高的而特异PCR阴性，抗体阳性率低的而特异PCR检测阳性率为27.3%，抗体水平与特异PCR检测结果的相关性也需进一步研究。

总之，弓形虫病新的诊断技术仍然在不断探索之中，将那些能够判定现症感染的诊断技术广泛应用于养猪生产实践中，积累更多更全面的流行病学资料，建立一套猪场弓形虫感染准确预警机制，必然会将弓形虫病的有效防控工作提升到更高水平。

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