3 流行病学及公共卫生意义

隐孢子虫广泛分布于全球50多个国家，感染200多种动物，宿主之间的直接接触或因环境、食物、饮水的间接污染是造成卵囊传播的主要原因。人兽共患隐孢子虫因其特殊的宿主特异性，更加剧了动物与人之间的交叉传播，具有重要的公共卫生意义。调查发现发达国家免疫功能正常人群粪便中卵囊阳性率为1%，经济落后的国家和地区免疫功能正常人群粪便中的卵囊阳性率为5%-10%(Checkley et al., 2015)。隐孢子虫感染在艾滋病患者中感染率达48%左右，长期腹泻是诱发艾滋病病人过早死亡的重要因素之一。最近的流行病学数据显示，在非洲、亚洲部分地区，对超过22000名5岁以下腹泻儿童进行病原调查分析发现，隐孢子虫感染成为仅次于轮状病毒感染的第二大腹泻病原，也是引发1-2岁婴幼儿死亡的主要原因(Kotloff et al., 2013)。该病对低龄儿童和免疫缺陷人群表现出极高的易感性。Ajjampur等(Ajjampur et al., 2010)调查发现，印度5岁以下发病儿童中，2岁以下的幼儿占75%。大量研究证明隐孢子虫感染与儿童的营养不良和生长缓慢直接相关，即使是无症状的感染也会引起儿童明显的生长受阻，有症状的感染则比无症状感染对儿童的生长发育影响更大。Elwin等(Elwin et al., 2012)对英国的调查研究表明，C. parvum在乡村人群中感染率比较高，与动物感染密切相关，春季是发病高峰期，而C. hominis在城市儿童中的感染率较高，发病高峰在夏末秋初。Wade 等(Wade et al., 2000)认为，本病的发生没有明显的季节性。由于流行病学是一个综合的因素, 地理分布、降水、气温、土壤、场舍、管理均和流行病学有关, 所以不同地域各季节的动态变化不尽相同。

由于隐孢子虫卵囊体积微小、分布广泛，常规加氯饮水消毒法不能有效将其杀灭，因此对人类公共卫生造成严重威胁。伴随人类活动范围的扩大，城乡人员流动性的加大，不同种类的隐孢子虫交叉感染的可能性增加，尤其是人兽共患虫种在人群中的感染几率将会增加。Feng等(Feng et al., 2012)发现我国上海住院病人中C. meleagridis的阳性率为21.4%，并在上海的城市污水中同时检测到 C. meleagridis、C. baileyi和艾美耳球虫（Eimeria spp.）卵囊，推测城市中的感染性卵囊可能来自养禽场(Li et al., 2012)。

犬、猫隐孢子虫感染人的病例在美国、法国、西班牙、意大利、英国、秘鲁、印度和泰国等均有报道，所报道的病例中很大一部分都是免疫功能不全或者是免疫缺陷的患者，只有极少数病例是免疫系统健全的患者(Elwin et al., 2012; Insulander et al., 2013)。在我国人感染犬、猫隐孢子虫的报道较少，仅Wang等(Wang et al., 2011)在对河南省郑州、开封和林州3个地区人隐孢子虫感染情况调查时发现1名5岁免疫系统健全的女童被确认为C. felis阳性。猫隐孢子虫的宿主范围很窄，自然感染情况下主要在猫、牛和人的体内检测到。目前有关猫感染的隐孢子虫虫种的资料报道还比较少，仅有C. parvum，C. felis和C. muris３种隐孢子虫可感染猫。犬隐孢子虫的感染率在3.71%-30.18%之间(齐萌等, 2010)。猪隐孢子虫和鼠隐孢子虫报道相对较少，Lin等(Lin, et al., 2015)对我国陕西省断奶后仔猪和成年猪调查发现，猪隐孢子虫的感染率为3.3%，不同猪场间的流行率在0-14.4%之间。Lv等(Lv et al., 2009)研究发现，在我国宠物市场中仓鼠C. muris感染率为12%，毛竹鼠C. muris感染率为2.0%。本课题组对广东省部分地区流浪犬猫、野生猕猴、肉鸽、黄牛、水牛等动物进行隐孢子虫流行病学调查，结果发现除野生猕猴和流浪犬为阴性外，其他动物均发现有隐孢子虫感染。其中，流浪猫感染率为0.375%，优势种为C. felis；黄牛和水牛感染率为13.95%, 但多为C. andersoni；肉鸽感染率为0.82%，并首次从鸽粪中分离到C. meleagridis，具有重要的公共卫生意义。除了以上几种主要的人兽共患隐孢子虫，Jiang等(Jiang et al., 2014)对我国江苏门诊腹泻病人调查时发现，安氏隐孢子虫（C. andersoni）是感染优势种，虽然笔者认为其未对该分离株的生物学特性进行系统研究，尚不可定论，但推测该分离株可能和日本分离的“新型安氏隐孢子虫”为同一型。那么来自于牛的C. andersoni 究竟是否在进化过程中完成了对人类宿主的适应性，还需要进一步的研究数据支持，但是在一定程度上提示隐孢子虫的人兽互传特性在快速城镇化进程的当今社会将会表现的愈加明显。

4 临床症状及致病机制

人或动物感染隐孢子虫常出现腹泻症状，幼龄个体常伴随昏睡、食欲不振、发热、脱水和体质变差等临床特征。腹泻粪样中卵囊高峰期OPG（每克粪便中的卵囊数）值可达105-107。人工感染犊牛106个卵囊引起的腹泻可持续4-18d，通常6d，严重脱水少见。临床上，犊牛的隐孢子虫感染常常伴随大肠杆菌和轮状病毒混合感染。病理组织学上呈现典型的肠炎变化，小肠远端绒毛萎缩、融合，表面上皮细胞转变为低柱状或立方形细胞，长细胞变性或脱落，微绒毛变短。单核细胞、嗜中性粒细胞浸润固有层。盲肠、结肠和十二指肠也可感染。所有部位隐窝扩张，内含坏死组织碎片，营养物质消化、转运、吸收出现障碍，引起消化不良和腹泻(Bouzid et al., 2013)。

隐孢子虫影响幼龄个体生长发育的机制似乎与对小肠产生的炎症性损伤有关。小肠吸收受损和分泌增加可能促进腹泻疾病和生长发育迟缓。Carneiro-Filho等(Carneiro-Filho et al., 2003)通过小鼠模型研究进一步发现，营养不良动物相较于健康动物感染隐孢子虫时虫荷更大、损伤更多。Kirkpatrick等(Kirkpatrick et al., 2008)对动物、儿童和HIV阳性患者腹泻研究发现，丙氨酰谷氨酰胺可提高肠道修复和吸收并预防生长发育迟缓。Oria等(Oria et al., 2007)发现ApoE E4等位基因与预防重症腹泻儿童患者的生长发育迟缓有关，动物实验表明拥有ApoE E4等位基因与降低虫荷和炎症损伤相关。   

5 诊断及治疗  

5.1 诊断方法

对于寄生虫病的诊断，虫卵/卵囊的显微镜检一直被奉为金标准。由于隐孢子虫感染多呈隐性经过, 该病的诊断只能靠实验室显微镜检观察到虫体, 或用免疫学技术检测隐孢子虫抗原或抗体, 或用分子生物学技术检测种属特异性基因片段。显微镜检是一个重要的诊断方法，其仪器、试剂成本低，操作简单，但敏感性低，漏检率高，且无法鉴定隐孢子虫种和基因型。Chalmers等(Chalmers et al., 2011)通过对7种隐孢子虫诊断方法进行比较研究发现，与免疫荧光抗体染色方法相比，改良抗酸染色法的敏感性为70%，但与分子检测技术相比，该方法仍存在超过一半的漏检病例。免疫荧光技术（Immunofluorescent technique, IFT）也是目前国内外学者检测隐孢子虫常用的方法之一。该法敏感性、特异性和重复性较好，成为欧美实验室诊断的金标准。其他抗原检测方式，如酶免疫方法和免疫色谱技术，目前都具有商品化试剂盒，更适用于高通量的检测，但诊断敏感性参差不齐（70%-100%）(Chalmers et al., 2011)。某些快速检测对隐孢子虫的其他种类的特异性和敏感性要低于C. parvum和C. hominis，确诊是需要设定阳性对照(Robinson et al., 2010)。无论是有症状的隐孢子虫病还是无症状的隐孢子虫病，都会引起特异性抗体的应答，尤其是对于低虫荷量的感染，血清学抗体检测方法表现出较大的优势。虽然IgA反应呈现一过性，但是IgG抗体会持续较长一段时间。Priest等(Priest et al., 2006)通过对秘鲁隐孢子虫感染儿童研究发现，抗Cp23抗体与长期慢性感染相关，抗Cp17（也叫gp15）抗体与急性感染相关，而抗P2抗体与重复感染相关。隐孢子虫感染标记性抗体的筛选仍需要更多的研究数据来支持。由于早期的抗体检测需要血液量较大，给大规模的流行病学研究带来不便。伴随检测仪器的逐步高端化，目前依靠Luminex的血清学诊断平台可以实现微量的样本检测，如指尖血或口腔拭子，较大的降低了样本采集的难度，提高了隐孢子虫流行病学研究的进度(Griffin et al., 2011; Lammie et al., 2012)。

随着分子生物学技术的快速发展，以PCR技术为基础的检测方法以其高度的敏感性、特异性优势不断得到国内外研究学者的青睐。如PCR、套式PCR、荧光定量PCR、多重荧光PCR、PCR-限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）、环介导等温扩增（LAMP）、高分辨率溶解曲线（HRM）、多位点分析（MLST）等新的分子检测技术都已经成功应用到对隐孢子虫的临床检测。检测隐孢子虫的靶基因以核糖体18SrRNA居多，60KD糖蛋白（gp60），热休克蛋白70（Hsp70）以及囊壁蛋白（COWP）也有用到。种系发育分析对于辨别隐孢子虫的种类、基因型是必不可少的，使用PCR扩增获得18S rRNA的基因的800bp片段进行分析是最常见的，多用于种上水平的鉴定，Hsp70、gp60基因多被用于种下水平的基因型的分析(Mazurie et al., 2013)。另外基于小的扩增片段建立的荧光定量快速检测方法以其简便、快捷等优势愈发被人们所关注(Elwin et al., 2012; Hadfield et al., 2011)。

多位点分型技术（MLST）是在多位点酶电泳方法的基础上发展改进而来的，该方法通过高分辨率的检测和分析，能对隐孢子虫进行深入的基因分型和群体遗传结构研究。Feng等(Feng et al., 2011)于2011年首次建立了C. muris和C. andersoni的MLST检测方法，在13个备选位点中最后选取4个进行MLST分析，取得理想结果。Li等(Li et al., 2013)利用MLST方法对来自秘鲁腹泻儿童的53个隐孢子虫分离株进行了32个遗传位点的序列分析，通过连锁不平衡和重组分析，证实该地区IbA10G2亚型为主要致病亚型。Wang等(Wang et al., 2012)通过对来源于我国河南、陕西、吉林等的鼠隐孢子虫和安氏隐孢子虫进行MLST分析，共鉴定出2个鼠隐孢子虫MLST亚型和10个安氏隐孢子虫MLST亚型，构成5个不同的遗传群体。2014年Wang等(Wang et al., 2014)研究团队又利用MLST方法对来自中国、瑞典、埃及的C. parvum IId分离株进行分析，同时选取微卫星、小卫星以及SNP位点作为扩增位点，获得了25个MLST亚型，分析结果揭示C. parvum IId家族为一个单独的群体结构，有可能是从亚洲西部分散到其他流行地区的。 由于MLST分析方法在群体遗传结构分析、溯源追踪等方面表现出优势，伴随高通量测序成本的降低，该方法将会越来越多的被用到隐孢子虫的种系发育分析研究中。   

5.2 治疗及防控策略

隐孢子虫几乎对所有的抗球虫药物都不敏感，目前已尝试过的治疗药物包括硝唑尼特、巴龙霉素、阿奇霉素和大环内酯类抗生素等，但是效果不佳。其中硝唑尼特是美国FDA唯一批准的仅可用于艾滋病病人隐孢子虫病治疗的药物(Cohen, 2005)。与疟原虫和弓形虫等其他顶复虫不同, 隐孢子虫缺失顶端体和线粒体基因，其代谢途径极其简化，很多营养物质都靠从宿主摄取，缺失三羧酸循环、磷酸戊糖旁路、氨基酸和核苷酸合成等多种代谢途径,而且某些基因和生化代谢途径非常类似于植物和细菌,常规代谢途径上的许多常见药物靶点在隐孢子虫上都无法利用，给药物筛选工作带来了巨大的困难。然而基本的核代谢途径，能量代谢和脂代谢途径在隐孢子虫中是存在的，鉴于这些代谢通路在人和动物中的差别很大，符合药靶选择的基础条件，从这些代谢途径上寻找药物靶点成为开发抗隐孢子虫药物的突破口(Rossignol, 2010)。Abrahamsen等(Abrahamsen et al., 2004)曾在2004年证实C. parvum基因组编码3个长链脂酰辅酶A合成酶（LC-ACS）在脂肪酸代谢中具有重要作用。Guo等(Guo et al., 2014)针对这一作用靶点，采用ACS抑制剂triacsin C分别进行体外和体内实验对ACS进行作用，验证其对C. parvun对小鼠的感染的影响，结果表明该抑制剂在对抗小鼠隐孢子虫感染上具有较好的效果。

鉴于隐孢子虫不能从头合成嘌呤核苷酸，但具有从宿主或外界环境获得腺苷的能力，这一代偿途径上的关键酶成为抗隐孢子虫药物靶标筛选的另一个重要关注点(Kirubakaran et al., 2012)。Striepen等(Striepen et al., 2002; Striepen et al., 2004)早期研究发现隐孢子虫次黄嘌呤单磷酸脱氢酶（IMPDH）基因似乎是从一种细菌中通过基因转移获得，近期Mandapati等(Mandapati et al., 2014)的研究表明隐孢子虫IMPDH抑制物同样具有抗菌活性，在一定程度上补充了Striepen早期的观点。详细的酶动力学分析发现，隐孢子虫的IMPDH与人的IMPDH具有极低的同源性，符合作为药物候选分子的条件，并不断得到众多研究学者的证实(Gorla et al., 2012; Gorla et al., 2013; Sharling et al., 2010)。鉴于合成新药的昂贵费用，借助体外培养平台，从已有的化合物库中筛选对隐孢子虫有效的药物也是一个不错的选择，Bessoff 等(Bessoff et al., 2013)通过对727个化合物进行筛选，获得16个有活性的抑制物，包括人的3—羟基—3甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂伊伐他汀和醋硫葡金。近期的研究证明，这2种被用来治疗人的类风湿性关节炎的药物在体外模式下对隐孢子虫的感染具有一定的效果(Debnath et al., 2013)，对动物和人的体内实验验证尚待进一步完成。   

中药方面的研究相对西药滞后，发现大蒜素、苦参碱、黄芪、银杏酸、当归补血汤及其多糖对隐孢子虫感染有一定效果（陈静等，2011）。伴随药物残留和多重耐药等问题的日趋严重，无抗养殖模式越来越多的引起了人们的关注。本课题组曾在复方中药防治贝氏隐孢子虫感染研究中做过尝试，结果筛选到中药复方（川楝子、槟榔、常山、石榴皮、地榆）在雏鸡采食量、增重量、卵囊减少量以及寄生器官损伤程度上都表现出一定效果，提示该中药复方可能对贝氏隐孢子虫的感染具有潜在的防治作用。复方中药在近代临床观察和药理研究中证明：苦楝皮的乙醇提取物、槟榔碱、川楝素、南瓜子、青蒿琥酯和使君子等药物具有较好的驱虫效果，且副作用小。同时配合健胃消食的中药，健运脾胃、补养气血，能大大缓解寄生虫导致的肠胃等器官损伤、功能紊乱以及营养不良和消瘦。目前临床上应用的驱虫中药采用多味药材复合而成，既有药物成分，又有健胃和诱食成分，在未来的抗隐孢子虫药物筛选中具有一定的应用前景。

由于对隐孢子虫保护性免疫应答机制的研究尚不清楚，疫苗研究相对滞后。但众多研究证明宿主的免疫机能状态与虫体感染密切相关，高度流行区的成年人对再次感染有部分保护性免疫，而免疫缺陷个体的易感性明显增加，这在一定程度上显示出疫苗防御的可行性(McDonald et al., 2013; Mead, 2010)。早期研究曾用隐孢子虫致弱虫株对易感动物进行免疫保护性试验，如Jenkis等(Jenkins et al., 2004)于2004年使用伽马射线辐照的C.parvum卵囊免疫奶牛，结果证实可产生一定的免疫保护力。随后Sheoran等(Sheoran et al., 2012)在猪体试验证实，C. hominis特异性免疫对同种卵囊的感染具有较好的保护力，但是再次感染异种卵囊如C. parvum，则表现出部分交叉保护力，但是其感染后的症状和卵囊排出量均较未免疫组轻。由于活卵囊疫苗具有潜在的危险性，随着隐孢子虫基因组编辑技术的不断完善，希望基因工程疫苗的研究将会有一个突破性的发展。

鉴于尚无好的抗隐孢子虫药物和疫苗的面世，做好预防工作仍是防制该病的最佳办法。隐孢子虫病主要通过水源和食物传播，人兽共患隐孢子虫在人与不同动物之间的交叉传播特性使得人畜感染的几率大幅增加，因而切断传播途径是控制该病的关键环节。注意环境卫生，防止食物和饮水受病畜、宠物等粪便污染，对于偏远农村，一定要做好人粪便的管理，防止动物食入人粪或人粪污染水源。隐孢子虫卵囊对外界环境因素抵抗力较强，常规的处理方法不能有效的去除或杀死卵囊，可用100mL/L福尔马林、50mL/L氨水消毒处理或65℃加热30 min以上破坏卵囊，对于饮用水可以采用臭氧消毒。另外增强人和动物自身免疫力，提高人的安全防护意识也是抵抗该病感染的关键因素。  

6 小结与展望

综上所述，在过去的20年里，虽然隐孢子虫相关研究有了突飞猛进的进展，尤其在遗传结构、系统分类以及检测方法方面，但是作为最重要的4种腹泻病原之一，隐孢子虫致病机制及防控方法的研究远远落后于其他3种病原（轮状病毒、志贺氏菌和产肠毒素大肠杆菌）(Striepen, 2013)。隐孢子虫作为危害严重的食源性寄生虫之一，具有重要的公共卫生意义。建立低虫荷、多重感染鉴别检测方法，完善种属亚型的确定以及建立溯源监测体系等工作仍需要进一步的展开。优化体外培养条件，明晰隐孢子虫致病机制，与宿主细胞互作机制，有效的利用新型基因编辑工具进行系统的功能研究是药物筛选和疫苗研制亟待解决的问题。相信伴随分子生物学、细胞生物学技术的不断进步，尤其是隐孢子虫功能基因组、蛋白组、代谢组学研究的深入，人们对隐孢子虫入侵机制、免疫防御机制的认识会提升到一个新的高度，为新药和疫苗的研制开拓新篇章。

作者：李娟，孙铭飞，张健騑*，吴彩艳，廖申权，吕敏娜，戚南山，林栩慧

作者单位：广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东省兽医公共卫生公共实验室

节选自《防疫一线》2016年第4期总47期